Информация » Выделение мембранных белков » Метод кругового дихроизма

Метод кругового дихроизма

Метод основан на измерении разности поглощения лево - и правополяризованного света; эта оптическая активность является мерой хиральности молекул, или мерой их асимметрии. В дальней ультрафиолетовой области (от 190 до 240 нм) КД определяется в основном поглощением амидов карбонильных групп полипептидного остова. При наличии участков вторичной структуры, например α-спиралей, спектр КД имеет вполне определенные особенности, связанные с особенностями электронного окружения амидных групп в этих структурах. Анализируя спектр КД белков, его обычно представляют как сумму компонентов, отвечающих поглощению разных участков белковой молекулы: α-спиралей, β-слоев и случайных клубков. Определив тем или иным способом спектры каждой из этих структур, производят их суммирование, подбирая соответствующие коэффициенты таким образом, чтобы было достигнуто наилучшее соответствие измеренному спектру. Подобранные весовые коэффициенты представляют собой ту долю, которая приходится в молекуле на каждый из типов вторичной структуры.

Эти методы были разработаны для растворимых белков, но нет никаких оснований сомневаться, что их можно с успехом применять и для мембранных белков. Скорее всего, у последних имеются участки с такими же типами вторичной структуры, как и у растворимых белков, и при их изучении возникнут такие же трудности. Некоторые белки можно изучать in situ, используя суспензии мембран. Примерами такого рода являются бактериородопсин из пурпурной мембраны Halobacterium halobium и Са2 + - АТР-аза из мембраны саркоплазматического ретикулума. Очищенные мембранные белки можно исследовать с помощью КД и в присутствии детергентов, если поглощение последних в дальней УФ-области не слишком велико, или в составе реконструированных везикул. Здесь возникают две проблемы:

1) дифференциальное светорассеяние, когда размер мембранных частиц гораздо больше длины волны света;

2) выравнивание поглощения из-за концентрирования белка в мембранах или везикулах, т.е. из-за негомогенности его распределения в растворе. Эти артефакты могут быть весьма существенными, однако их можно учесть с помощью соответствующих методов.

К сожалению, для внутренних мембранных белков отсутствуют структурные данные высокого разрешения, поэтому точная интерпретация спектров КД невозможна. За исключением нескольких случаев, разные спектральные методы не использовались для изучения одного и того же белка и количественное сравнение результатов не проводилось. Интересно, что для бактериородопсина, который исследовали методами КД, ИК и ЯМР, во всех трех случаях были получены одинаковые результаты, свидетельствующие о значительном содержании в этом белке β-слоев. Тем не менее у каждого метода имеются существенные недостатки. Так, данные о высоком содержании в бактериородопсине β-слоев (-46%) в значительной мере зависят от способа учета оптических артефактов. Судя по данным электронно-микроскопической реконструкции, характеризующимся относительно низким разрешением, в бактериородопсине 80% приходится на долю α-спиралей, а β-слои отсутствуют совсем. Чтобы понять причину этих несоответствий, необходимо провести структурный анализ белка с атомным разрешением.


Похожие материалы:

Круговорот калия
Калий, как известно, принимает участие в процессах фотосинтеза, оказывает влияние на углеводный, азотный и фосфорный обмен, существенным образом сказывается на осмотических свойствах клеток. Он концентрируется в плодах и семенах, в интенс ...

Нервные окончания
Конечные разветвления нейронов образуют нервные окончания, которые контактируют с тканями (органами), воспринимающими нервные импульсы из центра, либо с тканями (органами), передающими воздействие внутренней и внешней среды и способствующ ...

Интегральные белки
При обработке мембран для получения интегральных мембранных белков могут высвобождаться или активироваться протеазы. Поэтому нередко на этой стадии приходится добавлять ингибиторы протеаз, даже если они уже были введены на предыдущих этап ...