Информация » Выделение мембранных белков » Изучение стехиометрии субъединиц

Изучение стехиометрии субъединиц

Многие мембранные ферменты представляют собой комплексы, состоящие из нескольких субъединиц. В качестве примера можно привести Н + - АТРазу, Na +/ К + - АТРазу, митохондриальные комплексы электронного транспорта и фотосинтетические реакционные центры. Некоторые интегральные мембранные белки прочно связаны с растворимыми белками с помощью нековалентных взаимодействий (примерами могут служить Fo - и F1-компоненты митохондриальной Н + - АТРазы). В Е. сoli Fo-компонент, содержащий по данным электрофореза в ПААГ-ДСН три типа субъединиц (а, b, с), образует протонный канал, a F1, состоящий из пяти типов субъединиц, содержит активный центр, участвующий в гидролизе АТР. Для таких белков очень важно определить характер субъединиц, стехиометрию комплекса и ближайшие взаимодействия его компонентов. Это весьма непростая задача даже тогда, когда белковый комплекс уже изолирован. Возникающие здесь проблемы по существу не отличаются от таковых для растворимых белковых комплексов, но имеются и свои дополнительные сложности.

Прежде всего следует иметь в виду, что взаимодействие между субъединицами очень сильно зависит от типа липидов и детергентов, с которыми связаны белки.

Еще одна проблема связана с тем, что в бислое мембранные белки могут образовывать комплексы из-за высокой их локальной концентрации. При солюбилизации же независимо от используемого детергента может произойти разбавление мембранных белков и их разъединение. По закону действующих масс это приведет к диссоциации комплексов, в которых взаимодействие между компонентами не очень сильное.

Для изучения стехиометрии субъединиц и их ассоциации в очищенном комплексе используется всего несколько методов:

1) химическое сшивание;

2) количественный анализ N-концевых аминокислот;

3) определение отношения массы субъединиц в ДСН-полиакриламидных гелях путем определения интенсивности окрашивания, с помощью радиоавтографии или иммуноблоттинга.

Каждый метод имеет свои ограничения, но все они использовались на практике.


Похожие материалы:

Двоякодышащие рыбы.
Первые двоякодышащие рыбы появились на земле 390 миллионов лет назад и по праву могут считаться одними из самых древних рыб. Главная особенность двоякодышащих – то, что помимо жабр, которыми обладают все рыбы, они имеют и лёгкие. (Именно ...

Химические процессы в тропосфере
В химических превращениях различных загрязняющих веществ в тропосфере ключевое место занимает OH - радикал к образованию которого ведут несколько процессов. Основной вклад дают фотохимические реакции с участие озона: O3+h=O2+O O+H2O=OH+ ...

От чего могут засыхать чехлы у Cattleya
У недавно приобретенной в итальянском заказе Cattleya последовательно засыхают все чехлы. Она пришла с 2-мя чехлами в зачаточном состоянии, затем они вылезли целиком (не одновременно) и, вроде, внутри стали набухать почки. Пару недель чех ...