Информация » Выделение мембранных белков » Изучение стехиометрии субъединиц

Изучение стехиометрии субъединиц

Многие мембранные ферменты представляют собой комплексы, состоящие из нескольких субъединиц. В качестве примера можно привести Н + - АТРазу, Na +/ К + - АТРазу, митохондриальные комплексы электронного транспорта и фотосинтетические реакционные центры. Некоторые интегральные мембранные белки прочно связаны с растворимыми белками с помощью нековалентных взаимодействий (примерами могут служить Fo - и F1-компоненты митохондриальной Н + - АТРазы). В Е. сoli Fo-компонент, содержащий по данным электрофореза в ПААГ-ДСН три типа субъединиц (а, b, с), образует протонный канал, a F1, состоящий из пяти типов субъединиц, содержит активный центр, участвующий в гидролизе АТР. Для таких белков очень важно определить характер субъединиц, стехиометрию комплекса и ближайшие взаимодействия его компонентов. Это весьма непростая задача даже тогда, когда белковый комплекс уже изолирован. Возникающие здесь проблемы по существу не отличаются от таковых для растворимых белковых комплексов, но имеются и свои дополнительные сложности.

Прежде всего следует иметь в виду, что взаимодействие между субъединицами очень сильно зависит от типа липидов и детергентов, с которыми связаны белки.

Еще одна проблема связана с тем, что в бислое мембранные белки могут образовывать комплексы из-за высокой их локальной концентрации. При солюбилизации же независимо от используемого детергента может произойти разбавление мембранных белков и их разъединение. По закону действующих масс это приведет к диссоциации комплексов, в которых взаимодействие между компонентами не очень сильное.

Для изучения стехиометрии субъединиц и их ассоциации в очищенном комплексе используется всего несколько методов:

1) химическое сшивание;

2) количественный анализ N-концевых аминокислот;

3) определение отношения массы субъединиц в ДСН-полиакриламидных гелях путем определения интенсивности окрашивания, с помощью радиоавтографии или иммуноблоттинга.

Каждый метод имеет свои ограничения, но все они использовались на практике.


Похожие материалы:

Поздние росты
У нескольких моих каттлей только в июле проснулись почки, и новые росты примерно 1 см размером. Вопрос: успеют ли они созреть к зиме-весне (чтобы зацвести), или сейчас их надо выламывать, т.к. толку от них все равно не будет? Ответ: Есл ...

Корпускулярно-волновой дуализм материи.
В 1924 г. произошло одно из величайших событий в истории физики: французский физик Л. де Бройль выдвинул идею о волновых свойствах материи. В своей работе «Свет и материя» он писал о необходимости использовать волновые и корпускулярные пр ...

Стресс при транспортировке
Условия нашей окружающей среды не всегда полезны орхидеям, поэтому они могут получить стресс от переохлаждения во время транспортировки домой. Признаком «транспортного стресса» является внезапная потеря одного или более листов в середине ...