Информация » Биосинтез мембранных белков и их встраивание в биомембрану » Методы исследования переноса белков через мембраны

Методы исследования переноса белков через мембраны
Страница 1

Наиболее детально изучены бесклеточные системы, в которых гораздо легче количественно исследовать процессы переноса и протеолитического процессинга белков. Во всех этих системах используются мембранные везикулы или препараты органелл, у которых поверхность, обращенная в цитоплазму, «смотрит» наружу, поскольку перенос белков осуществляется из цитоплазмы. Этому условию удовлетворяют микросомы, полученные из эндоплазматического ретикулума секретирующих клеток, митохондрий и хлоропластов. Вывернутые везикулы можно получить из клеток Е. coli, они представляют собой удобный объект для изучения переноса белков в бесклеточной системе.

Полипептид-предшественник, находящийся во внешней среде, при соответствующих условиях будет переноситься внутрь пузырька или, по крайней мере, через мембрану пузырька или органеллы. За этим процессом обычно следят, добавляя протеазы во внешнюю среду. Степень защиты от протеолиза является мерой количества полипептида, транспортированного внутрь везикулы или органеллы. За ходом протеолитического процесса, осуществляемого сигнальной пептидазой, следят с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии ДСН. Белки, встроившиеся в мембрану, можно идентифицировать с помощью щелочной экстракции, при этом предполагается, что белки, которые связаны с поверхностью мембран, при такой обработке удаляются. Однако так бывает не всегда, поэтому результаты, полученные с помощью щелочной экстракции, необходимо интерпретировать с осторожностью.

В таких бесклеточных системах можно изучать биохимические условия переноса белков и идентифицировать необходимые растворимые компоненты. Кроме того, при этом можно варьировать природу переносимого полипептидного «субстрата».

При изучении бесклеточных систем были получены весьма важные данные об условиях, необходимых для переноса белков.

1. Посттрансляционный и котрансляционный перенос. Принято считать, что во всех исследованных системах перенос в мембраны или через мембраны может осуществляться независимо от трансляции. Убедительные данные на этот счет были получены для процесса переноса белков в хлоропластах и митохондриях, а также для переноса через бактериальную мембрану. Долгое время считалось, что перенос белков в эндоплазматический ретикулум или через мембраны эндоплазматического ретикулума всегда осуществляется параллельно трансляции, однако было четко показано, что такая параллельность не обязательна. Также важным считается то, что энергия, необходимая для переноса, не исходит от рибосомного биосинтетического аппарата.

2. Энергетические требования к переносу. Как правило, перенос белков в мембраны или через них энергозависим. Необходимым условием переноса как для прокариотических, так и для эукариотических систем является гидролиз АТР (или другого нуклеозидтрифосфата). Это было показано для следующих процессов: а) переноса белков в строму хлоропластов; б) транспорта белков в митохондриальный матрикс, внутреннюю и наружную мембраны; в) переноса белков через эндоплазматический ретикулум дрожжей и посттрансляционного встраивания мембранных белков в эндоплазматический ретикулум млекопитающих; г) переноса белков через цитоплазматическую мембрану Е.coli.

Еще одним независимым условием переноса белков в матрикс митохондрий и во внутреннюю мембрану митохондрий является наличие на последней трансмембранного потенциала. Этот потенциал, очевидно, необходим на ранней стадии процесса, при связывании белка с митохондрией.

3. Способность предшественника к переносу. Имеются веские доводы в пользу того, что ключевую роль в успешном переносе белка играет его четвертичная структура. Скорее всего это связано с тем, что сигнальная последовательность(ти), узнаваемая аппаратом переноса, должна быть доступна для него. Следовательно, для осуществления переноса белок должен быть неплотно свернут или частично развернут. Кроме того, если белки переносятся через мембрану в вытянутой конформации, то аппарат переноса должен быть способен к их развертыванию во время самого процесса переноса. Если бы белки- предшественники обладали стабильной четвертичной структурой, то они с трудом развертывались бы и, следовательно, не были бы способны к переносу.

Страницы: 1 2


Похожие материалы:

Об одном орхидном мифе
Многие слышали историю о том, что Cattleya labiata была обнаружен случайно, когда прибыла в Англию в виде упаковочного материала для некоторых папоротников. Вильям Каттлей (с которого история началась) выбросил упаковочный материал под ла ...

Борьба за существование. Геометрическая прогрессия размножения и борьба за существование
Вы, наверное, слышали эту старинную задачу. "Индийский царь предложил изобретателю шахмат, чтобы он сам выбрал себе награду за создание этой игры. Тот попросил выдать ему за первую клетку шахматной доски одно пшеничное зерно, за втор ...

Функции, строение, кровоснабжение почек
Почки являются основным органом выделения. Они выполняют в организме много функций. Одни из них прямо или косвенно связаны с процессами выделения, другие - не имеют такой связи. Выделительная, или экскреторная, функция. Почки удаляет из ...